IT4IP核孔膜在诱导脂质囊泡膜融合和细胞内递送的应用研究

高分子聚合物薄膜经高能重离子辐照后，在薄膜中沿入射离子路径上会形成圆柱状损伤区域，直径约１０ｎｍ，这些损伤区域称作离子的潜径迹，潜径迹经过化学蚀刻处理可形成中空通道（孔），即为核孔膜。相比于常规滤膜，IT4IP核孔膜拥有众多优点，如表面平整光滑、孔径均一、圆柱形孔形（图１－１），此外还具有机械强度高、过滤速度快和截留特性好等优点。

核孔膜的生产工艺主要包括辐照、紫外敏化和蚀刻等三个主要步骤。辐照一般利用加速器或者反应堆进行，目前主要都采用加速器进行辐照。紫外敏化主要是改善核孔膜的孔形，让锥度更小、透气率更高、孔径更均匀。化学蚀刻则决定核孔膜最终孔径大小

基于IT4IP核孔膜的特点，其应用已相当广泛。目前，很多微生物检测、癌细胞的检测以及气体的检测都需要用到核孔膜截留取样。在制药工业，核孔膜主要用于药用水的过滤及终端除菌过滤，血液制品的过滤，空气与蒸汽的过滤等。在食品饮料行业，核孔膜用于酒类、饮用水、奶制品、茶饮料等的澄清和除菌过滤，可代替离心法用于分离，或代替热处理法用于除菌。在电子工业，可用于制备光刻胶及环境气体净化，以提高电子产品的质量和成品率。在化工业，IT4IP核孔膜用于制备超纯试剂及溶剂中贵重的悬浮物和触媒的回收等。此外，在药用及化妆品用脂质体制剂的研发和生产中，基于核孔膜的挤出法是脂质体粒径均一化及降低粒径的方法之一。

本文基于IT4IP核孔膜的挤出法进行了两部分研宄，一是挤出法诱导脂质囊泡膜融合并构建杂化外泌体，二是基于挤出法的细胞内递送研究。主要内容及结果如下：

１、挤出法诱导荧光标记脂质体与空白脂质体发生膜融合。采用荧光共振能量转移法对膜融合过程进行了定性和定量分析，并检测了膜融合前后脂质体粒径的变化，以冻融法作为对照。结果显示，经过挤出处理，焚光标记脂质体和空白脂质体发生了膜融合，也即荧光标记磷脂转移到空白脂质体，膜融合效率与冻融法相当，且耗时较短。相比冻融法，所制得的膜融合脂质体粒径均一。

２、挤出法可诱导荧光标记脂质体和外泌体发生膜融合，即构建杂化外泌体。首先用透射电镜对从Ｋ５６２培养上清提取的外泌体进行了鉴定，然后利用挤出法诱导荧光标记脂质体与外泌体发生膜融合，荧光共振能量转移法对膜融合过程进行了定性和定量分析，并检测了膜融合前后脂质囊泡粒径的变化，以冻融法作为对照。结果显示，经过挤出处理，焚光标记脂质体和外泌体发生了膜融合，但透射电镜下杂化外泌体仍然保持了典型的茶托结构。挤出法的膜融合效率稍低于冻融法，但其具有耗时短的优点。此外，挤出法制备的杂化外泌体具有较均匀的粒径，而冻融法构建的杂化外泌体则粒径及粒径分布范围都变大。

３、基于IT4IP核孔膜的挤出法可通过诱导ＣＴ２６细胞变形及细胞膜短暂穿孔而将介质中各种大分子递送进入细胞，经挤出处理的ＣＴ２６细胞仍可正常贴壁生长及增殖。膜孔径和递送材料的分子量是影响递送效率的重要因素。不同分子量右旋糖酐经挤出递送后，在细胞浆和细胞核都有分布，但是质核比与分子量呈正相关。

４、基于IT4IP核孔膜的挤出法可通过诱导Ｋ５６２细胞变形及细胞膜短暂穿孔而将介质中各种大分子递送进入细胞，经挤出处理的Ｋ５６２细胞任可正常生长及增殖。膜孔径和递送材料分子量是影响递送效率的重要因素。此外，不同分子量的右旋糖酐经挤出递送后，在细胞浆和细胞核都有分布，水合半径大于核膜复合体被动扩散尺度上限的２ＭＤａ右旋糖酐主要在挤出处理后起初的１小时内进入细胞核，这强烈提示挤出处理诱导了核膜破裂，从而允许其进入细胞核。